老师，RT-RCR反应失败的原因有哪些？

回复:（1）RT-PCR是多步反应，应首先检查反应体系。在确认PCR以及逆转录反应体系没有问题的情况下，RNA降解是导致实验失败的最主要的原因。可以取少量新鲜提取或冻存的RNA跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验完整性。以哺乳动物细胞/组织为例，完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为28 s、 18 s,、5 s；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即开始逆转录反应，并适量增大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。
（2）RNA的纯度影响后续反应：Vazyme（诺唯赞生物）RNA isolater基于异硫氰酸胍法，主要杂质来自于异硫氰酸胍等盐的残留，对后续酶反应有很大的影响。因此需要用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔细洗涤沉淀(轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟)。